Πώς διαβάζεται ένα πιστοποιητικό ανάλυσης (COA);

Το πιστοποιητικό ανάλυσης (Certificate of Analysis, COA) είναι το έγγραφο που καταγράφει τα αποτελέσματα εργαστηριακών δοκιμών σε μια συγκεκριμένη παρτίδα ενός υλικού. Για ένα συνθετικό πεπτίδιο, οι δοκιμές αυτές απαντούν σε τρία διαφορετικά ερωτήματα: ποιο μόριο υπάρχει στο δείγμα (ταυτότητα), τι μέρος του ανιχνεύσιμου υλικού είναι αυτό το μόριο (καθαρότητα) και πόση ουσία υπάρχει (περιεκτικότητα). Σε δοκιμές για ταυτότητα, καθαρότητα και περιεκτικότητα (strength) στηρίζεται και η αξιολόγηση της ποιότητας των συνθετικών πεπτιδικών φαρμάκων, με τη βοήθεια πρότυπων αναφοράς (McCarthy και συν., Pharm Res 2023, PMID 36949371).

Ένα COA δεν είναι ετικέτα. Η ετικέτα δηλώνει τι υποτίθεται ότι περιέχει ένα προϊόν. Το COA καταγράφει τι μετρήθηκε σε δείγμα της παρτίδας, με ποια μέθοδο και από ποιο εργαστήριο. Περισσότερα για τις κατηγορίες πεπτιδίων στον οδηγό «Τι είναι τα πεπτίδια».

Η μορφή διαφέρει από εργαστήριο σε εργαστήριο. Ένα πλήρες COA πεπτιδίου αναγράφει συνήθως:

• Ταυτότητα ουσίας: όνομα, αλληλουχία αμινοξέων ή μοριακό τύπο και θεωρητική μοριακή μάζα.
• Καθαρότητα, συνήθως με HPLC, ως ποσοστό.
• Ταυτοποίηση, συνήθως με φασματομετρία μάζας (MS): η μετρημένη μάζα δίπλα στην αναμενόμενη.
• Δηλωμένη ποσότητα ουσίας ανά συσκευασία και, όπου μετρήθηκε, την περιεκτικότητα που προσδιορίστηκε.
• Αριθμό παρτίδας (batch ή lot).
• Ημερομηνίες: την ημερομηνία της ανάλυσης και, συχνά, την ημερομηνία παραγωγής της παρτίδας.
• Το εργαστήριο που έκανε την ανάλυση, με επωνυμία και διεύθυνση, και την υπογραφή του υπευθύνου.
• Τα χρωματογραφήματα και τα φάσματα, δηλαδή τα ίδια τα γραφήματα από τα οποία προέκυψαν τα αποτελέσματα.

Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) διαχωρίζει τα συστατικά ενός δείγματος καθώς περνούν μέσα από μια στήλη. Κάθε συστατικό εμφανίζεται ως κορυφή σε ένα γράφημα, το χρωματογράφημα. Το ποσοστό καθαρότητας προκύπτει από το εμβαδόν της κύριας κορυφής σε σχέση με το συνολικό εμβαδόν όλων των κορυφών.

Το «98%» ή το «99%» είναι επομένως σχετικό μέγεθος: δείχνει τι μέρος των ουσιών που κατέγραψε ο ανιχνευτής αντιστοιχεί στην κύρια κορυφή. Σε μια μεθοδολογική μελέτη οι συγγραφείς σημείωσαν ότι η εκτίμηση της καθαρότητας από τα εμβαδά της υπεριώδους (UV) απορρόφησης προϋποθέτει ότι η απορρόφηση είναι ομοιόμορφα ανάλογη της μάζας, και γι' αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να είναι μόνο ημιποσοτικό (Preston και Phillips, Anal Bioanal Chem 2016, PMID 26879647).

Το ποσοστό καθαρότητας δεν λέει ποια είναι τα υπόλοιπα συστατικά. Στα συνθετικά πεπτίδια, τα συστατικά αυτά περιλαμβάνουν συγγενικά πεπτίδια, όπως αλυσίδες όπου λείπει ή περισσεύει ένα αμινοξύ (EMA/CHMP/CVMP/QWP/367182/2025).

Η φασματομετρία μάζας (MS) μετρά τη μάζα των μορίων του δείγματος. Σε ένα COA, η μετρημένη μάζα συγκρίνεται με τη θεωρητική μάζα της αλληλουχίας που δηλώνεται. Όταν συμφωνούν, το αποτέλεσμα υποστηρίζει ότι το κύριο μόριο είναι αυτό που αναγράφεται.

Η κατευθυντήρια γραμμή του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Φαρμάκων (EMA) για τα συνθετικά πεπτίδια, σε ισχύ από 1 Ιουνίου 2026, περιγράφει τη φασματομετρία μάζας ως ισχυρό εργαλείο για τη δομή των πεπτιδίων, που μπορεί να προσδιορίσει τη μοριακή μάζα και να επιβεβαιώσει την αλληλουχία αμινοξέων. Για την ταυτοποίηση του πεπτιδίου στην προδιαγραφή και στην αποδέσμευση της παρτίδας, η ίδια γραμμή συνιστά τουλάχιστον δύο ορθογώνιες μεθόδους, δηλαδή μεθόδους που στηρίζονται σε διαφορετική αρχή μέτρησης (EMA/CHMP/CVMP/QWP/367182/2025).

Η μάζα από μόνη της έχει όρια. Δύο αλυσίδες με τα ίδια αμινοξέα σε διαφορετική σειρά έχουν την ίδια μάζα. Ορισμένα χαρακτηριστικά, όπως αμινοξέα με ίδια μάζα ή κατοπτρικές μορφές αμινοξέων, μπορεί να χρειάζονται πρόσθετες τεχνικές για πλήρη χαρακτηρισμό ενός πρότυπου αναφοράς πεπτιδίου (McCarthy και συν., Pharm Res 2023, PMID 36949371).

Η καθαρότητα HPLC αφορά μόνο τα συστατικά που ανιχνεύει η μέθοδος. Η λυοφιλοποιημένη σκόνη ενός πεπτιδίου όμως περιέχει και νερό, καθώς και ένα αντισταθμιστικό ιόν. Η κατευθυντήρια γραμμή του EMA αναφέρει ότι συνήθως χρησιμοποιείται το οξικό, ενώ είναι δυνατά και άλλα, όπως το τριφθοροοξικό ή το χλωρίδιο. Η ίδια γραμμή ζητά η περιεκτικότητα που μετριέται με υγρή χρωματογραφία να εκφράζεται ως άνυδρη ουσία χωρίς το αντισταθμιστικό ιόν, εκτός αν αιτιολογείται διαφορετικά (EMA/CHMP/CVMP/QWP/367182/2025).

Γι' αυτό ένα υλικό μπορεί να έχει πολύ υψηλή καθαρότητα HPLC και χαμηλότερη καθαρή περιεκτικότητα σε πεπτίδιο. Η καθαρότητα απαντά στο «τι άλλο υπάρχει δίπλα στο μόριο». Η περιεκτικότητα απαντά στο «πόσο μόριο υπάρχει». Ένα COA που αναγράφει μόνο καθαρότητα δεν δίνει τη δεύτερη πληροφορία.

Πρώτον, δεν λέει τι είναι το υπόλοιπο 1%. Η κατευθυντήρια γραμμή του EMA παραθέτει τα όρια της Ευρωπαϊκής Φαρμακοποιίας για τις πεπτιδικές προσμείξεις: αναφέρονται πάνω από 0,1%, ταυτοποιούνται πάνω από 0,5% και υπόκεινται σε διαδικασία qualification, δηλαδή τεκμηρίωσης του επιπέδου τους, πάνω από 1,0% (EMA/CHMP/CVMP/QWP/367182/2025). Στο φαρμακευτικό πλαίσιο, δηλαδή, οι προσμείξεις αντιμετωπίζονται ως ξεχωριστά, καταγεγραμμένα στοιχεία της προδιαγραφής και όχι ως αδιαφοροποίητο υπόλοιπο.

Δεύτερον, δύο ουσίες μπορεί να εμφανιστούν στο ίδιο σημείο του χρωματογραφήματος. Σε μελέτη με δείγματα ενός συνθετικού πεπτιδικού φαρμάκου, δύο δομικά παρόμοιες προσμείξεις συνεκλούονταν, δηλαδή δεν διαχωρίζονταν με τη συνήθη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης (RP-HPLC). Μετρήθηκαν με υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας, με όρια ανίχνευσης τόσο χαμηλά όσο 0,01% και 0,02% αντίστοιχα (Kodidasu και συν., J Am Soc Mass Spectrom 2025, PMID 40857144). Μια κορυφή που μοιάζει καθαρή μπορεί να περιέχει περισσότερα από ένα μόρια.

Τρίτον, το ποσοστό δεν λέει τίποτα για την ταυτότητα. Ένα υλικό μπορεί να έχει υψηλή καθαρότητα και να είναι άλλο μόριο από αυτό που δηλώνεται. Γι' αυτό η καθαρότητα διαβάζεται μαζί με την ταυτοποίηση.

Ένα COA δείχνει μόνο όσα μετρήθηκαν και αναγράφονται. Αν δεν υπάρχει γραμμή για μια δοκιμή, η δοκιμή αυτή δεν τεκμηριώνεται.

• Βακτηριακές ενδοτοξίνες και μικροβιολογική καθαρότητα. Οι ενδοτοξίνες είναι συστατικά του εξωτερικού τοιχώματος ορισμένων βακτηρίων και δεν φαίνονται στο HPLC ή στη φασματομετρία μάζας. Η κατευθυντήρια γραμμή του EMA τις καταγράφει, μαζί με τη μικροβιολογική καθαρότητα, ως χωριστά σημεία της προδιαγραφής.
• Υπολειμματικοί διαλύτες και στοιχειακές προσμείξεις, επίσης χωριστές δοκιμές στον κατάλογο του EMA.
• Άλλες παρτίδες. Το COA αφορά μόνο την παρτίδα της οποίας ο αριθμός αναγράφεται. Δεν μεταφέρεται σε προηγούμενη ή επόμενη παραγωγή, ακόμη κι αν το προϊόν έχει το ίδιο όνομα.
• Κάθε μονάδα χωριστά. Η ανάλυση γίνεται σε δείγμα της παρτίδας, όχι σε κάθε μονάδα συσκευασίας.

Ένα COA μπορεί να εκδοθεί από το εργαστήριο ποιοτικού ελέγχου του ίδιου του παραγωγού ή από εξωτερικό εργαστήριο που δεν συνδέεται με τον παραγωγό. Στη δεύτερη περίπτωση το αποτέλεσμα δεν προέρχεται από τον φορέα που παρήγαγε την παρτίδα.

Στοιχεία που επιτρέπουν να αξιολογηθεί ένα εργαστήριο είναι η πλήρης επωνυμία και διεύθυνσή του, η διαπίστευση κατά ISO/IEC 17025, το διεθνές πρότυπο για την επάρκεια των εργαστηρίων δοκιμών και διακρίβωσης, όπου αναφέρεται, και η δυνατότητα να επιβεβαιωθεί το έγγραφο απευθείας από το εργαστήριο, για παράδειγμα με αριθμό αναφοράς. Ένα COA χωρίς όνομα εργαστηρίου δεν επιτρέπει αυτή την επιβεβαίωση.

Ο αριθμός παρτίδας είναι ο κρίκος ανάμεσα στο έγγραφο και στο υλικό. Ο ίδιος αριθμός εμφανίζεται, χαρακτήρα προς χαρακτήρα, στο COA και στην ετικέτα της συσκευασίας. Αν οι δύο αριθμοί διαφέρουν, το COA περιγράφει άλλη παρτίδα.

Το ίδιο ισχύει για το όνομα της ουσίας και για τη δηλωμένη ποσότητα ανά συσκευασία, που συμφωνούν ανάμεσα στο έγγραφο και στην ετικέτα. Η ημερομηνία της ανάλυσης είναι ίδια ή μεταγενέστερη από την ημερομηνία παραγωγής της παρτίδας. Τα δημοσιευμένα πιστοποιητικά ανάλυσης συγκεντρώνονται στη Βιβλιοθήκη COA.

• Η επιβεβαίωση ενός COA εξαρτάται από το αν το εργαστήριο που το εξέδωσε απαντά σε ερωτήματα για τα έγγραφά του.
• Οι απαιτήσεις και τα όρια του EMA και της Ευρωπαϊκής Φαρμακοποιίας αφορούν φαρμακευτικά προϊόντα. Χρησιμοποιούνται εδώ ως σημείο αναφοράς για το τι περιλαμβάνει μια πλήρης ανάλυση, όχι ως περιγραφή του τι αναγράφει κάθε COA.
• Ένα COA αποτυπώνει το δείγμα την ημερομηνία της ανάλυσης.

Όχι. Αφορά μόνο την παρτίδα με τον αριθμό που αναγράφει.

Ότι η κύρια κορυφή του χρωματογραφήματος HPLC αντιστοιχεί στο 99% του συνολικού εμβαδού των κορυφών που ανιχνεύτηκαν. Από μόνο του δεν δείχνει ούτε την ταυτότητα ούτε την περιεκτικότητα.

Δεν αντικαθιστούν τις χωριστές δοκιμές που ο EMA καταγράφει στην προδιαγραφή, όπως οι ενδοτοξίνες, οι υπολειμματικοί διαλύτες και οι στοιχειακές προσμείξεις. Ένα COA τις καλύπτει μόνο αν αναγράφει ξεχωριστή δοκιμή με αποτέλεσμα.

• McCarthy D και συν. Pharm Res. 2023. PMID 36949371 · DOI 10.1007/s11095-023-03493-1
• Preston GW, Phillips DH. Anal Bioanal Chem. 2016. PMID 26879647 · DOI 10.1007/s00216-016-9334-1
• Kodidasu A και συν. J Am Soc Mass Spectrom. 2025. PMID 40857144 · DOI 10.1021/jasms.5c00105
• Ευρωπαϊκός Οργανισμός Φαρμάκων (EMA). Guideline on the Development and Manufacture of Synthetic Peptides. 2025. EMA/CHMP/CVMP/QWP/367182/2025, σε ισχύ από 1 Ιουνίου 2026 · https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-development-manufacture-synthetic-peptides_en.pdf

Ενημερωτικό κείμενο που συνοψίζει δημοσιευμένη έρευνα. Δεν αποτελεί ιατρική συμβουλή ούτε οδηγία χρήσης.